邵雨潇, 王强, 边政宇, 刘浩然, 李想, 闫艳, 王彦海, 赵利美
目的: 原核表达多房棘球绦虫铁蛋白(Echinococcus multilocularis ferritin, EmFer),结合生物信息学方法分析其T细胞与B细胞表位,并制备相应多克隆抗体。方法: 利用在线工具预测EmFer的亚细胞定位及二、三级结构,进一步识别潜在的T、B细胞表位。以多房棘球绦虫原头节cDNA为模板,通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)扩增获得铁蛋白Emfer基因,将其克隆至pET28a(+)载体,构建重组质粒pET28a(+)-EmFer;采用PCR、双酶切及测序鉴定重组载体,并转化至BL21(DE3)表达感受态细胞中,用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside, IPTG)诱导表达;运用12.5%的SDS-PAGE电泳及Western Blot对表达的重组EmFer(recombinant Echinococcus multilocularis ferritin, rEmFer)进行分析鉴定。将纯化后的rEmFer免疫BALB/c小鼠,制备多克隆抗体,运用ELISA检测其抗体效价,并通过Western Blot检测所获小鼠免疫血清是否能够特异识别rEmFer。结果: 亚细胞定位预测显示EmFer可能定位于细胞质,T、B细胞表位预测表明EmFer具有6个T、B细胞联合表位,分别是5 aa-10 aa,38 aa-40 aa,57 aa-61 aa,118 aa-120 aa,122 aa,139 aa。成功构建了重组质粒pET28a(+)-EmFer,转化BL21(DE3)表达感受态细胞后,经诱导表达和纯化获得了纯度较高的不可溶性重组蛋白rEmFer,相对分子质量约为22 000(含表达载体序列);免疫小鼠后获得的多克隆抗体效价达1∶1 280 000,并能与rEmFer发生特异性结合。结论: 成功表达了多房棘球绦虫铁蛋白,且铁蛋白具有较好的免疫原性,预测其含有T、B细胞表位。研究结果为包虫病的防控及疫苗研发提供了理论依据